HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)/HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

A.    Prinsip Dasar

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)/HPLC (High Performance Liquid Chromatography) adalah suatu metoda kromatografi yang mampu memisahkan makro molekul, senyawa-senyawa ionik, produk alam yang lebih, senyawa polimerik dan kelompok-kelompok polifungsional yang memiliki berat molekul tinggi dengan cara penyairan berfraksi, penyerapan atau penukaran ion. Menggunakan fase yang interaktif dan fase diam padat atau cair yang aktif.

KCKT secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.

Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.

Kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi dan detektor yang sensitif telah menyebabkan perubahan kromatografi kolom cair menjadi suatu sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi.metode ini dikenal dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).

B.     Proses Pemisahan

KCKT adalah suatu metoda kromatografi yang mampu memisahkan makro molekul, senyawa-senyawa ionik, produk alam yang lebih, senyawa polimerik dan kelompok-kelompok polifungsional yang memiliki berat molekul tinggi dengan cara penyairan berfraksi, penyerapan atau penukaran ion. Menggunakan fase yang interaktif dan fase diam padat atau cair yang aktif.

Ada 3 sistem KCKT yang dikenal, yaitu:

1.      Sistem elusi isokratik (isocratic elution)

Sampel diinjeksikan ke dalam kolom yang komposisi fasa geraknya tidak berubah selama analisis dilakukan sampai sampel terelusi dari kolom, sistem isokratik yang memiliki nilai k’ (rasio atau koefisien partisi yang bervariasi) akan menghasilkan resolusi yang buruk dan sukar mendeteksi pita elusinya.

2.      Sistem elusi gradient (gradient elution)

Ada perubahan fasa gerak baik secara bertahap atau berkesinambungan selama proses berlangsung. Pada mula-mula elusi, seluruh komponen sampel ditahan di bagian atas kolom, setelah gradien mulai, kekuatan elusi fase gerak akan meningkat. Pada akhirnya harga k’ akan menjadi cukup kecil sehingga komponen zat tersebut akan bermigrasi sepanjang kolom secara cepat sampai keluar dari kolom.

Persamaan elusi gradient :

Waktu retensi      = tg  =tMk log (2,3 k_o/k)

Resolusi               = Rs =[(1/4)(α-1)N^1/2] [k/1+ k]

Lebar pita            =       =1/2[V_M(1+k)N^1/2]

Dimana :

Ko = nilai k’ pada awal pemisahan

tg   = waktu retensi pada elusi gradien

g    = lebar pita gradien

tM  = waktu transit zat yang ditahan

α    = retensi relatif

V_M = volume gerak

N   = jumlah pelat (kromotof)

Nilai k selama migrasi harus berkisar pada rentang 1<10. Pada saat keluar kolom, k menjadi (~1). Nilai k kecil pada saat elusi menghasilkan pita tajam dan berarti sensitifitasnya tinggi.

3.      Sistem elusi bertahap

Baik digunakan untuk sampel yang mengandung komponen-komponen yang bergerak cepat, yang diikuti senyawa-senyawa yang lambat gerakannya, tetapi tidak mengandung senyawa dengan nilai k’ setelah sampai diinjeksikan. Komposisi fase gerak secara bertahap diganti.

Beberapa jenis teknik pemisahan dalam KCKT telah dikembangkan berdasarkan jenis fase diam dan fase geraknya:

a. Kromatografi adsorpsi

Fase diam yang biasa digunakan adalah bahan alam polar seperti partikel silika atau alumina hidrat. Fase mobil berkompetisi terhadap lokasi aktif adsorpsi pada partikel fase diam. Komponen yang terikat lebih kuat akan tertahan lebih lama di dalam kolom. Waktu retensi bergantung pada kepolaran sampel.

b. Kromatografi partisi

Linarut dibagi atas fase gerak cair dengan cairan yang tidak bercampur yang dilapiskan pada suatu patikel padat sebagai fase diam. Fase diam dapat berupa fase diam yang disalutkan pada partikel penyangga. Kolom fase terikat (bonded-fase colum) merupakan kolom yang paling umum digunakan.

c. Kromatografi penukar ion

Prinsip kerja berdasarkan partisi ion antara fase gerak dan fase diam pada lokasi penukaran ion. Pemisahan terjadi akibat partisi ion dalam derajat yang berbeda.

C.    Contoh

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan suatu metoda pemisahan canggih dalam analisis farrnasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemumian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan Kromatografi Gas. Banyak senyawa yang dapat dianalisis, dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat /bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral (chirale Trennphasen) yang mampu menentukan rasemis dan isomer aktif.

Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal, namun metoda ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 jenis obat / bahan obat karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi, waktu analisis cepat

Tabel 4.1 : Daftar Obat – obat yang Penetapan Kadarnya dengan KCKT (FL Edisi IV)

1. Tablet Asetazolamida

2. Asetilsistein

3. Larutan Asetilsistein

4. Tablet Asetosal

5. Asam Aminokaproat

6. Asam Aminosalisilat

7. Asam Folat '

8. Tablet Asam Folat

9. Asam Mefenarnat

10. Kapsul Asam Mefenamat

11. Asiklovir

12. Tablet Allopurinol

13. Alprozolam

14. Tablet Alprozolam

15. Amikasin Sulfat

16. Injeksi Amikasin Sulfat

17. Aminofilin

18. Amoksihn .

19.Kapsu Armoksilin

20. Amoksilin untuk Suspensi Oral

21. Ampisilin