HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)/HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

A.    Prinsip Dasar

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)/HPLC (High Performance Liquid Chromatography) adalah suatu metoda kromatografi yang mampu memisahkan makro molekul, senyawa-senyawa ionik, produk alam yang lebih, senyawa polimerik dan kelompok-kelompok polifungsional yang memiliki berat molekul tinggi dengan cara penyairan berfraksi, penyerapan atau penukaran ion. Menggunakan fase yang interaktif dan fase diam padat atau cair yang aktif.

KCKT secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.

Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.

Kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi dan detektor yang sensitif telah menyebabkan perubahan kromatografi kolom cair menjadi suatu sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi.metode ini dikenal dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).

B.     Proses Pemisahan

KCKT adalah suatu metoda kromatografi yang mampu memisahkan makro molekul, senyawa-senyawa ionik, produk alam yang lebih, senyawa polimerik dan kelompok-kelompok polifungsional yang memiliki berat molekul tinggi dengan cara penyairan berfraksi, penyerapan atau penukaran ion. Menggunakan fase yang interaktif dan fase diam padat atau cair yang aktif.

Ada 3 sistem KCKT yang dikenal, yaitu:

1.      Sistem elusi isokratik (isocratic elution)

Sampel diinjeksikan ke dalam kolom yang komposisi fasa geraknya tidak berubah selama analisis dilakukan sampai sampel terelusi dari kolom, sistem isokratik yang memiliki nilai k’ (rasio atau koefisien partisi yang bervariasi) akan menghasilkan resolusi yang buruk dan sukar mendeteksi pita elusinya.

2.      Sistem elusi gradient (gradient elution)

Ada perubahan fasa gerak baik secara bertahap atau berkesinambungan selama proses berlangsung. Pada mula-mula elusi, seluruh komponen sampel ditahan di bagian atas kolom, setelah gradien mulai, kekuatan elusi fase gerak akan meningkat. Pada akhirnya harga k’ akan menjadi cukup kecil sehingga komponen zat tersebut akan bermigrasi sepanjang kolom secara cepat sampai keluar dari kolom.

Persamaan elusi gradient :

Waktu retensi      = tg  =tMk log (2,3 k_o/k)

Resolusi               = Rs =[(1/4)(α-1)N^1/2] [k/1+ k]

Lebar pita            =       =1/2[V_M(1+k)N^1/2]

Dimana :

Ko = nilai k’ pada awal pemisahan

tg   = waktu retensi pada elusi gradien

g    = lebar pita gradien

tM  = waktu transit zat yang ditahan

α    = retensi relatif

V_M = volume gerak

N   = jumlah pelat (kromotof)

Nilai k selama migrasi harus berkisar pada rentang 1<10. Pada saat keluar kolom, k menjadi (~1). Nilai k kecil pada saat elusi menghasilkan pita tajam dan berarti sensitifitasnya tinggi.

3.      Sistem elusi bertahap

Baik digunakan untuk sampel yang mengandung komponen-komponen yang bergerak cepat, yang diikuti senyawa-senyawa yang lambat gerakannya, tetapi tidak mengandung senyawa dengan nilai k’ setelah sampai diinjeksikan. Komposisi fase gerak secara bertahap diganti.

Beberapa jenis teknik pemisahan dalam KCKT telah dikembangkan berdasarkan jenis fase diam dan fase geraknya:

a. Kromatografi adsorpsi

Fase diam yang biasa digunakan adalah bahan alam polar seperti partikel silika atau alumina hidrat. Fase mobil berkompetisi terhadap lokasi aktif adsorpsi pada partikel fase diam. Komponen yang terikat lebih kuat akan tertahan lebih lama di dalam kolom. Waktu retensi bergantung pada kepolaran sampel.

b. Kromatografi partisi

Linarut dibagi atas fase gerak cair dengan cairan yang tidak bercampur yang dilapiskan pada suatu patikel padat sebagai fase diam. Fase diam dapat berupa fase diam yang disalutkan pada partikel penyangga. Kolom fase terikat (bonded-fase colum) merupakan kolom yang paling umum digunakan.

c. Kromatografi penukar ion

Prinsip kerja berdasarkan partisi ion antara fase gerak dan fase diam pada lokasi penukaran ion. Pemisahan terjadi akibat partisi ion dalam derajat yang berbeda.

C.    Contoh

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan suatu metoda pemisahan canggih dalam analisis farrnasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemumian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan Kromatografi Gas. Banyak senyawa yang dapat dianalisis, dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat /bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral (chirale Trennphasen) yang mampu menentukan rasemis dan isomer aktif.

Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal, namun metoda ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 jenis obat / bahan obat karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi, waktu analisis cepat

Tabel 4.1 : Daftar Obat – obat yang Penetapan Kadarnya dengan KCKT (FL Edisi IV)

1. Tablet Asetazolamida

2. Asetilsistein

3. Larutan Asetilsistein

4. Tablet Asetosal

5. Asam Aminokaproat

6. Asam Aminosalisilat

7. Asam Folat '

8. Tablet Asam Folat

9. Asam Mefenarnat

10. Kapsul Asam Mefenamat

11. Asiklovir

12. Tablet Allopurinol

13. Alprozolam

14. Tablet Alprozolam

15. Amikasin Sulfat

16. Injeksi Amikasin Sulfat

17. Aminofilin

18. Amoksihn .

19.Kapsu Armoksilin

20. Amoksilin untuk Suspensi Oral

21. Ampisilin

Soxhletasi

PERCOBAAN 1

A. Judul                   :   Ekstraksi Minyak Kedelai Secara Soxhletasi

B. Tujuan                :   Agar mahasiswa dapat memahami cara penggunaan dan prinsip metode soxhletasi   

C. Dasar Teori

1. Pengertian

Sokletasi adalah suatu metode pemisahan suatu komponen yang terdapat dalam sampel padat dengan cara penyarian berulang – ulang dengan pelarut yang sama, sehingga semua komponen yang diinginkan dalam sampel terisolasi dengan sempurna. Pelarut yang digunakan ada 2 jenis, yaitu heksana ( C₆H₁₄  ) untuk sampel kering dan metanol (CH₃OH ) untuk sampel basah. Jadi, pelarut yang dugunakan tergantung dari sampel alam yang digunakan. Nama lain yang digunakan sebagai pengganti sokletasi adalah pengekstrakan berulang – ulang ( continous extraction ) dari sampel pelarut.[1]

Sokletasi adalah suatu metode / proses pemisahan suatu komponen yang terdapat dalam zat padat dengan cara penyaringan berulang-ulang dengan menggunakan pelarut tertentu, sehingga semua komponen yang diinginkan akan terisolasi.[2]

Sokletasi adalah suatu metode / proses pemisahan suatu komponen yang terdapat dalam zat padat dengan cara penyaringan berulang ulang dengan menggunakan pelarut tertentu, sehingga semua komponen yang diinginkan akan terisolasi.[3].

Ekstraksi adalah penguraian zat-zat berkhasiat atau zat aktif dibagian tanaman, hewan dan beberapa jenis ikan pada umumnya mengandung senyawa-senyawa yang mudah larut dalam pelarut organic. Pada umumnya zat aktif dari tanaman dan hewan terdapat didalam sel namun sel tanaman dan hewan berbeda begitu pula ketebalan sel masing-masing berbeda, sehingga diperlukan metode ekstraksi dan pelarut tertentu dalam mengekstraksinya. Proses terekstraksinya zat aktif dalam sel tanaman adlah pelarut organic akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dalam pelarut organic tersebut sehingga terjadi perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dan pelarut organic diluar sel, maka larutan terpakat akan berdistribusi keluar sel dan proses ini terulang terus sampai terjadi keseimbangan antara konsentrasi cairan zat aktif didalam sel dan diluar sel.[4]

2. Prinsip dasar

Prinsip sokletasi adalah pelarut dan sampel dipisahkan ditempat yang berbeda. Sampel adalah bahan alam yang belum mengalami proses apapun juga. Metode sokletasi yang dilakukan memiliki kelebihan dan kekurang. Berikut adalah kelebihan metode sokletasi:

1.    Sampel terekstraksi dengan sempurna

2.    Proses ekstraksi lebih cepat

3.    Pelarut yang digunakan sedikit.

Sedangkan kelemahan dari metode sokletasi adalah sampel sampel yang digunakan harus sampel yang digunakan harus sampel yang tahan panas atau tidak dapat digunakan pada sampel yang tidak tahan panas. Karena sampel yang tidak tahan panas akan teroksidasi atau tereduksi ketika proses sokletasi berlangsung. Penyarian zat aktif yang dilakukan dengan cara serbuk simplisia dimaserasi selama 3 jam, kemudian simplisia dipindahkan ke dalam bejana silinder yang bagian bawahnya diberi sekat berpori, cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui simplisia tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif dalam sel-sel simplisia yang dilalui sampai keadaan jenuh.

Penarikan komponen kimia yang dilakukan dengan cara serbuk simplisia ditempatkan dalam klonsong yang telah dilapisi kertas saring sedemikian rupa, cairan penyari dipanaskan dalam labu alas bulat sehingga menguap dan dikondensasikan oleh kondensor bola menjadi molekul-molekul cairan penyari yang jatuh ke dalam klonsong menyari zat aktif di dalam simplisia dan jika cairan penyari telah mencapai permukaan sifon, seluruh cairan akan turun kembali ke labu alas bulat melalui pipa kapiler hingga terjadi sirkulasi

Metoda sokletasi seakan merupakan penggabungan antara metoda maserasi dan perkolasi. Jika pada metoda pemisahan minyak astiri ( distilasi uap ), tidak dapat digunakan dengan baik karena persentase senyawa yang akan digunakan atau yang akan diisolasi cukup kecil atau tidak didapatkan pelarut yang diinginkan untuk maserasi ataupun perkolasi ini, maka cara yang terbaik yang didapatkan untuk pemisahan ini adalah sokletasi.

Sokletasi digunakan pada pelarut organik tertentu. Dengan cara pemanasan, sehingga uap yang timbul setelah dingin secara kontunyu akan membasahi sampel, secara teratur pelarut tersebut dimasukkan kembali kedalam labu dengan membawa senyawa kimia yang akan diisolasi tersebut. Pelarut yang telah membawa senyawa kimia pada labu distilasi yang diuapkan dengan rotary evaporator sehingga pelarut tersebut dapat diangkat lagi bila suatu campuran organik berbentuk cair atau padat ditemui pada suatu zat padat, maka dapat diekstrak dengan menggunakan pelarut yang diinginkan.[5]

D. ALAT DAN BAHAN

Ø  Alat

 

      Rangkaian Soxhletasi                 Evaporator                        Penangas Air

        

               Labu erlenmeyer            Kertas saring                Neraca analitik

       Spatula                        Lumpang dan Alu      

Ø  Bahan

 

Kedelai                                  n-Heksana                     batu didih

E. Prosedur Kerja

 

F. Hasil Pengmatan dan Perhitunganerhitungan

Soxhletasi	Selang waktu (menit)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	09.32 – 10.04 10.04 – 10.15 10.15 – 10.21 10.21 – 10.34 10.34 – 10.36 10.36 – 10.46 10.46 – 10.49 10.49 – 10.54 10.54 – 11.00 11.00 – 11.02 11.02 – 11.09 11.09 – 11.17 11.17 – 11.22 11.22 – 11.30 11.30 – 11.40 11.40 – 11.44 11.44 – 11.49 11.49 – 11.52 11.52 – 12.01 12.01 – 12.09 12.09 – 12.13 12.13 – 12.22 12.22 – 12.41

Perhitungan
Dik      : Berat sampel                                               = 10 gram

              Berat minyak kedelai yang terekstrak    = 1,49 gram

Dit       : Persentase minyak kedelai dalam daging kedelai?

Peny :

                                           = 14,9 %

G. Pembahasan

Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan dari bahan padat maupun cair dengan bantuan pelarut. Pelarut yang digunakan harus dapat mengekstrak substansi yang diinginkan tanpa melarutkan material lainnya.selain itu ekstraksi juga dapat diartikan sebagai penguraian zat-zat berkhasiat atau zat aktif dibagian tanaman, hewan dan beberapa jenis ikan pada umumnya mengandung senyawa-senyawa yang mudah larut dalam pelarut organic.

Prinsip Kerja Soxhletasi Penyairan secara berkesinambungan dimana cairan penyari dipanaskan sehingga menguap, uap cairan akan terkondensasi molekul-molekul cairan penyari oleh pendingin balik dengan turun kedalam klonsong menyari simplisia dan selanjutnya masuk kembali kedalam labu alas bulat setelah melewati pipa siphon, proses ini berlangsung hingga penyarian zat aktif menjadi sempurna.

Pada percobaan ini langkah awal yang dilakukan adalah dengan merangkai alat soxchletasi. Langkah selanjutnya yaitu menghaluskan daging biji kedelai yang dihaluskan dengan lumpang dan alu sampai benar-benar halus, selanjutnya menimbang serbuk kemiri 10 gram. Banyaknya sampel yang dibutuhkan tergantung dari besarnya klonsong yang digunakan, karena jika sampel terlalu banyak maka sampel tidak akan masuk ke kedalam klonsong maupun tingginya sample akan melewati siphon.

Selanjutnya serbuk kedelai tersebut dibungkus dengan kertas saring. Cara membungkus sampel harus hati-hati, terlebih dahulu kertas saring digulung sesuai dengan diameter klonsong (tetapi tidak menyentuh dinding klonsong), dan tingginya sesuai dengan siphon. Untuk mengikatnya juga diperlukan kecermatan agar kertas saring tidak hancur dan harus disisahkan benang untuk pengikatan yang bagian atas, hal ini berfungsi agara sampel bisa kita keluarkan dengan cara menariknya lewat benang tersebut. Setelah itu dimasukkan kedalam tempat ekstraktor soxhlet. Memasukkan 65 mL n-hexan dan batu didih kedalam labu bulat, fungsi dari batu didih tersebut agar menjaga suhu dari n-heksana, dan kemudian mengalirkan air pada pendingin (kondensor) fungsi dari kondensor yaitu untuk mengubah zat penyari dalam hal ini n-heksana menjadi molekul-molekul penyari atau mengubah uap menjadi cairan. Langkah selanjutnya yaitu mengamati sirkulasi (perputaran/perpindahan) yang terjadi pada proses soxhletasi dan rentang waktu yang dibutuhkan.

Pada ekstraktor Soxhlet, pelarut dipanaskan dalam labu didih sehingga menghasilkan uap. Uap tersebut kemudian masuk ke kondensor melalui pipa kecil dan keluar dalam fasa cair. Kemudian pelarut masuk ke dalam selongsong berisi padatan. Pelarut akan membasahi sampel dan tertahan di dalam selongsong sampai tinggi pelarut dalam pipa siphon sama dengan tinggi pelarut di selongsong. Kemudian pelarut seluruhnya akan menggejorok masuk kembali ke dalam labu didih dan begitu seterusnya. Peristiwa ini disebut dengan efek siphon. Pada ekstraktor Soxhlet cairan akan menggejorok ke dalam labu setelah tinggi pelarut dalam selongsong sama dengan pipa siphon. Hal ini menyebabkan ada bagian sampel yang berkontak lebih lama dengan cairan daripada bagian lainnya. Sehingga sampel yang berada di bawah akan terekstraksi lebih banyak daripada bagian atas. Akibatnya ekstraksi menjadi tidak merata. Penarikan komponen kimia yang dilakukan dengan cara serbuk simplisia ditempatkan dalam klonsong yang telah dilapisi kertas saring sedemikian rupa, cairan penyari dipanaskan dalam labu alas bulat sehingga menguap dan dikondensasikan oleh kondensor bola menjadi molekul-molekul cairan penyari yang jatuh ke dalam klonsong menyari zat aktif di dalam simplisia dan jika cairan penyari telah mencapai permukaan siphon, seluruh cairan akan turun kembali ke labu alas bulat melalui pipa kapiler hingga terjadi sirkulasi

Tujuan dilakukan evaporator adalah untuk menguapkan larutan atau zat yang telah diekstraksi. Setelah dilakukan pengolahan data ternyata % zat aktif dalam kedelai adalah 14%.  Hal ini mungkin dipengaruhi oleh ekstraksi yang kurang sempurna.

H.   Kesimpulan

Berdasarkan atas percobaan dan pembahasan yang dilakukan maka adapun kesimpulan yang ditarik yaitu :

v  Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan dari bahan padat maupun cair dengan bantuan pelarut. Pelarut yang digunakan harus dapat mengekstrak substansi yang diinginkan tanpa melarutkan material lainnya.

v  Tujuan ekstraksi adalah untuk menarik semua komponen kimia yang terdapat dalam simplisia. Ekstraksi ini didasarkan pada perpindahan massa komponen zat padat ke dalam pelarut dimana perpindahan mulai terjadi pada lapisan antar muka, kemudian berdifusi masuk ke dalam pelarut.

Daftar Pustaka

Anetha.2012.  http://aneetha_soeka.student.fkip.uns.ac.id/fun/sokletasi/.com   diakses tanggal 27 april 2012

Astuti N. Sinambela http://astuti_soeka.student.fkip.uns.ac.id/fun/sokletasi/ diakses tanggal 27 april 2012

Rini rahmawati.2012. http://rinirahmayanti18.blogspot.com/2012/02/sokletasi.html.

Diakses tanggal 26 april 2012

Win aramico http://kakandaaramico.blogspot.com/2012/02/laporan-praktikum-sokletasi.html diakses tanggal 27 april 2012

Team Teaching, 2012, Penuntun Praktikum; hal: 8-9.Gorontalo: Universitas Negeri Gorontalo

---

[1]Anetha.2012.  http://aneetha_soeka.student.fkip.uns.ac.id/fun/sokletasi/.com   diakses tanggal 27 april 2012

[2] Astuti N. Sinambela

[3] Win aramico http://kakandaaramico.blogspot.com/2012/02/laporan-praktikum-sokletasi.html

[4] Team Teaching; Penuntun Praktikum; hal: 8-9

[5] Rini rahmawati.2012. http://rinirahmayanti18.blogspot.com/2012/02/sokletasi.html.